Paper: ER-phagy, VAMP7-Dependent Secretion of RTN3 and Neurite Growth CFATG
Paper: ER-phagy, VAMP7-Dependent Secretion of RTN3 and Neurite Growth
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Role of VAMP7-Dependent Secretion of Reticulon 3 in Neurite Growth

José Wojnacki, Sébastien Nola, Philippe Bun, Béatrice Cholley, Francesca Filippini, Mary T. Pressé, Joanna Lipecka, Sin Man Lam, Julie N’guyen, Axelle Simon, Amine Ouslimani, Guanghou Shui, Claudio Marcelo Fader, Maria Isabel Colombo, Ida Chiara Guerrera and Thierry Galli. Cell Reports. DOI: 10.1016/j.celrep.2020.108536. Pubmed PMID: 33357422.

Contacts: Thierry Galli thierry.galli@inserm.fr

Lien vers l’article / Link to the paper: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2211124720315254

Résumé de l’article:
Dans cet article nous montrons que la croissance axonale est affectée par une déprivation en nutriments et des drogues qui activent (Rapamycine, Resvératrol, Torine-1) ou inhibent (Spautin-1) l’autophagie. La déprivation, obtenue en diluant les acides aminés, les vitamines et le supplément N2 du milieu de culture neuronal, stimule la croissance axonale. Les activateurs d’autophagie stimulent la croissance axonale, sans affecter la polarisation axonale. Paradoxalement, Spautin-1 stimule également la croissance axonale mais d’une manière radicalement différente puisqu’elle inhibe également la polarisation axonale avec des neurones traités présentant plusieurs axones au lieu d’un seul. Mettant à profit les cellules PC12, un modèle de cellules de type neuronal qui peuvent être facilement manipulées génétiquement, nous avons caractérisé les cellules invalidées pour VAMP7 et ATG5. VAMP7, un SNARE vésiculaire des endosomes tardifs sécrétoire, a en effet été précédemment montré pour médier la croissance des neurites évoqués par le NGF dans les cellules PC12. VAMP7 avait aussi été impliqué dans l’autophagie, en particulier chez la mouche où VAMP8 n’est pas présent. ATG5 est une composante précoce essentielle de la macroautophagie. Les cellules VAMP7 KO montrent une diminution tandis que les cellules ATG5 KO montrent une croissance accrue des neurites. La rapamycine n’augmente que la croissance du neurite le plus long et cet effet n’est pas observé dans les cellules VAMP7 KO.
L’analyse par lipidomique et protéomique du contenu cellulaire et du sécrétome, la validation des cibles par western blot et l’exploration de l’effet de l’expression cellulaire d’un anticorps synthétique anti-VAMP7 et du domaine amino-terminal Longin de VAMP7 nous conduisent alors au concept que des éléments du reticulum endoplasmique destinés à être dégradés par reticulophagie sont également libérés dans des vésicules extracellulaires. Cette voie de sécrétion, que nous appelons ‘secretory ER-phagy’ (SERP), permet la libération de molécules liées à la réticulophagie telles que réticulons 1, 3 et 4, atlastines 1 et 3, Calcoco 1 et LC3-II. La SERP est augmentée lorsque la réticulophagie dégradative est bloquée, par exemple en éliminant ATG5 ou en altérant le pH lysosomal par l’inhibiteur de la V-ATPase, filomycineA1. La SERP est fortement inhibée en éliminant VAMP7. L’expression d’un anticorps synthétique VAMP7 empêche la croissance axonale induite par la déprivation et l’expression du domaine Longin affecte fortement la localisation subcellulaire du réticulon 3 sous Rapamycine.
En conclusion, nous proposons que SERP dépendante de VAMP7 est un mécanisme crucial dans la croissance des neurites.

Abstract:
Here we found that axonal growth is affected by partial starvation and drugs which activate (Rapamycin, Resveratrol, Torine-1) or inhibit (Spautin-1) autophagy. Partial starvation, achieved by diluting aminoacids, vitamins and N2 supplement of the neuronal culture medium, stimulates axonal growth. Autophagy activators stimulate axonal growth, without affecting axonal polarization. Paradoxically, Spautin-1 also stimulates axonal growth but in a radically different manner since it also inhibits axonal polarization with treated neurons showing multiple axons instead of only one. We then took advantage of PC12 cells, a model of neuronal-like cells which can be easily genetically manipulated. We characterized VAMP7- and ATG5-KO cells. VAMP7, a secretory late endosome vesicular SNARE, was indeed previously shown to mediate NGF-evoked neurite growth in PC12 cells. VAMP7 had previously been involved in autophagy, particularly in the fly where VAMP8 is not present. ATG5 is an essential early component of macroautophagy. We confirmed that VAMP7 KO cells show decreased whereas ATG5 KO cells show increased neurite growth. Rapamycin only increases growth of the longest neurite and this effect is not seen in VAMP7 KO cells.
Thorough lipidomics and proteomics and cell content and their secretome, validation of hits by western blotting, and exploration of the effect of cellular expression of an anti-VAMP7 synthetic antibody and the Longin amino-terminal domain of VAMP7 then lead us to the concept that ER elements destined to be degraded by ER-phagy are also released in large extracellular vesicles. This secretory route, which we refer to as secretory ER-phagy (SERP), allows for the release of ER-phagy-related molecules reticulons 1, 3 and 4, atlastins 1 and 3, Calcoco 1, and LC3-II. SERP is greatly enhanced when degradative ER-phagy is blocked such as by knocking out ATG5 or impairment of lysosomal pH by V-ATPase inhibitor BafilomycineA1. SERP is strongly inhibited by knocking out VAMP7. Expression of a VAMP7 synthetic antibody prevents starvation-induced axonal growth and expression of the Longin domain strongly affects the subcellular localization of reticulon 3 upon Rapamycin.
In conclusion, we propose that VAMP7-dependent SERP is a crucial mechanism in neurite growth.

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